الگوی شاخ فوقانی

تغییر مورفولوژیکی Primordia شاخ و دوره Prepupal در Trypoxylus dichotomus.

(الف) (الف) شماتیک نمای جلو سر لارو از t. DICHOTOMUSسبز ، چشمی (OC) ؛Magenta ، clypeolabrum ؛Cl ، Clypeus ؛LB ، لابروم.(ب) ، (ج) تصاویر میکرو-CT از سر پیشپیه در 24 ساعت APF از t. DICHOTOMUS(ب) نمای جلو. سرهای فلش سبز نشان دهنده موقعیت یک بخش ساژیتال در (c) است. ج) بخش ساژیتال سر. شاخ سر پریموردیا در بالای Clypeus در Clypeolabrum (فیلم S1) تشکیل شد.(ب) تغییرات مورفولوژیکی پریموردیا شاخ سر و قفسه سینه در طول رشد لارو-پوپال که توسط سیستم عکاسی با گذشت زمان نشان داده شده است. هم در مردان (پانل های فوقانی در نیمه فوقانی) و هم در زنان (پانل های فوقانی در نیمه پایانی) ، Primordia شاخ در کلیپولابروم تشکیل شد. در نرها ، دیدگاههای جبهه در مورد شاخ سر پریموردیا از 12 ساعت APF تا 36 ساعت APF ارائه شده است ، و دیدگاه های anterodorsal در مورد Primordia شاخ سر از 48 ساعت APF تا 120 ساعت APF ارائه شده است. در زنان ، نماهای جلو ارائه شده است که شاخ سر از 12 ساعت APF تا 48 ساعت APF نشان داده شده است ، و نماهای anterodorsal ارائه می شود که نشان دهنده Primordia شاخ سر از 60 ساعت تا 120 ساعت APF است. دیدگاههای پشتی نشان دهنده پریموردیا شاخ قفسه سینه است. APF ، پس از تشکیل اتاق توله سگ ؛HH ، Head Ho Primordia ؛Th ، Primordia شاخ قفسه سینه ؛سرهای فلش نارنجی ، اولین نکات دیستال دوقطبی یک شاخ سر. سرهای فلش سبز ، نکات دیستال دوم شاخدار یک شاخ سر. سرهای فلش آبی ، ساقه ستون بلند به شکل شاخ سر. سرهای فلش بنفش ، نکات دیستال دوقطبی یک شاخ قفسه سینه. میله های مقیاس 5 میلی متر است.(ج) تصاویر عکس فوری از عکاسی با گذشت زمان (فیلم S2). پانل در سمت چپ یک تصویر خام منفرد از عکاسی با گذشت زمان است که 64 لارو بطری شده در لوله های تست پلاستیکی 100 میلی لیتری را به طور همزمان مشاهده می کند. سه پانل در سمت راست تصاویر بزرگ شده T. dichotomus در مراحل مختلف رشد است.(د) مدت دوره های پیش از پیش در مردان و زنان با استفاده از سیستم عکاسی با گذشت زمان تخمین زده می شود. میانگین ، مقادیر فوقانی/پایین و حداقل/حداکثر توسط یک جعبه و ویسکر ارائه شد. مدت زمان متوسط دوره های مقدماتی در مردان و زنان به ترتیب 131 ساعت و 129 ساعت بود. ميانگين مدت زمان پيشرفت در زنان TDIC-TRA RNAI 127 ساعت بود كه كوتاه تر (4 ساعت) از زنان معمولاً توسعه یافته بود.

شکل 2

بازنمایی شماتیک ساختارهای اگزون-اینترون قلمداد و الگوهای ترکیبی خاص جنسی از ژنهای تعیین جنسیت.

(الف) شماتیک ساختارهای اگزون-ایندرون قلمداد ژنهای تعیین جنسیت در t. DICHOTOMUSجعبه نارنجی ، RRM (نقوش اتصال RNA) ؛جعبه سبز ، CAM (C ، Ceratitis ؛ A ، API ؛ M ، MUSCA) دامنه [34 ، 47] ، که در کلیه ارتولوگ های TRA مشخص شده در سایر حشرات به جز برای گونه های Drosophila و Sandfly (Phlebotomus papatasi) حفظ می شود [48] ؛جعبه آبی روشن ، دامنه MED29 (زیر واحد مجتمع واسطه 29) ؛جعبه قهوه ای ، دامنه DM (Doublesex/MAB-3 DNA). جعبه زرد ، OD2 (oligomerization dmain 2) ؛میله های سیاه ، توالی الگو برای سنتز dsRNA. میله های سبز ، مناطق تقویت شده در تجزیه و تحلیل qRT-PCR. میله های سبز روشن ، منطقه تقویت شده برای آزمایش انواع مختلف ترکیب جنسی. خطوط Magenta ، سایت های شروع ترجمه ؛خطوط بنفش ، کدون را متوقف کنید.(ب) ارزیابی الگوهای بیان و الگوهای ترکیبی خاص جنسی در ژنهای تعیین جنسیت در Primordia شاخ پیشانی زن و مرد. cDNA های الگو از Primordia شاخ پیشانی در 72 ساعت APF بدست آمد. TDIC-RPL32 به عنوان یک کنترل داخلی برای RT-PCR استفاده شد. فلش های آبی ، محصولات PCR با انواع خاص مردان ؛فلش های Magenta ، محصولات PCR با انواع خاص ترکیب زنان. فلش های سیاه ، محصولات PCR در هر دو جنس تقویت می شوند.

شکل 3

فنوتیپ از دست دادن عملکرد با واسطه RNAi از ژنهای تعیین جنسیت.

(A) Representative individuals in each RNAi treatment in males (the left half) and females (the right half). Each dsRNA was injected into last-instar larvae. The negative control RNAi treatment ( EGFP dsRNA) showed no morphological defects. The upper row, the dorsal views of adults; the second row, the lateral views of a head and a prothorax in adults; the third row, the ventral views of adults; the forth row, magnified views of orange squares (IPP, intercoxal process of prosteum) in the third row. Scale bars are 1 cm in the upper three rows and 1 mm in the fourth row. (B) Quantification of the relative head and thoracic ho length in RNAi-treated individuals. Relative head and thoracic ho length in RNAi-treated males and females are plotted in the blue dots and the magenta dots, respectively. The relative ho lengths were standardized by dividing the ho length by the body size in each RNAi treated individual and by the mean ho length of the EGFP RNAi-treated males. Differences in ho length among individual RNAi treatments were compared using Brunner-Munzel test. These p-values were adjusted by the Bonferroni correction. Asterisks denote significance: n.s., p>0. 05 ؛*، پ<0.05. (C) Sex-specific splicing of Tdic-dsx in RNAi treatments targeting Tdic-Sxl , Tdic-tra , Tdic-tra2 and Tdic-ix . Blue arrowheads, male specific splicing pattes. Magenta arrowheads, female specific splicing pattes. Tdic-RpL32 was used as an inteal control for RT-PCR.

شکل 4

تخمین شروع برنامه توسعه شاخ وابسته به TDIC - DSX توسط TDI C-TRA RNAi.

(الف) رابطه بین نقاط زمانی تزریق TDIC-TRA DSRNA و میزان تحول جنسی. میزان تحول جنسی (مردانگی) فنوتیپ های زنان TDIC-TRA RNAi به سه کلاس طبقه بندی شد: (i) برجسته HH و TH شکل گرفتند (<7 h APF); (ii) only small HH was formed (5 h APF ~73 ساعت apf) ؛(iii) نه HH و نه TH مانند زنان عادی تشکیل نشدند (-3 ساعت APF~127H APF). HH ، Head Ho Primordia ؛TH ، شاخدار شاخدار Primordia. پانل Dot Plot نقاط زمانی تزریق TDIC-TRA DSRNA قبل از شفیره در هر کلاس بود. نقطه سبز ، نقطه Magenta ، و نقطه آبی به ترتی ب-3 ساعت APF ، -7 ساعت APF و 73 ساعت APF را نشان می دهد. میله های مقیاس 5 میلی متر است.(ب) دوره زمانی نسبی TDIC-TRA و سطح بیان mRNA TDIC-DSXF پس از تزریق TDIC-TRA DSRNA در 24 ساعت APF. سطح بیان mRNA در هر نقطه زمانی توسط qRT-PCR اندازه گیری شد. سطح بیان TDIC-TRA در 36 ساعت پس از تزریق به طور قابل توجهی کاهش یافت (P<0.015). The expression level of Tdic-dsxF tended to be decreasing as time went on, but there were no statistically significant difference (p<0.056). (C) Summary of sex transformation phenotypes and the estimated onset of the Tdic-dsx dependent ho developmental program. The magenta line is the boundary timepoints of phenotype (i). Red arrowheads indicate the timepoints corrected by the mRNA degradation delay (36 hours), which estimated by qRT-PCR. APF, after puapal-chamber formation; Red arrowhead, the estimated onset of the developmental program for sexually dimorphic ho formation driven by Tdic-dsx .

شکل 5

بیان فضایی و زمانی پروتئین TDIC-DSX در پریموریوم شاخ سر در طول رشد لارو-پوپال.

(A-F) The head epidermis including the head ho primordium was stained with DAPI (magenta) to label nuclei and with anti-Tdic-Dsx antibody (green) to label Tdic-Dsx protein. Tdic-Dsx protein showed higher expression in the head primordial epidermis than in the surrounding head epidermis. Between Orange-Orange arrowheads is the head ho primordium. Between Orange-Blue arrowheads is the surrounding head epidermis. (A-C) Tdic-Dsx expression patte in 12 h APF, Scale bars are 500 μm. (A’-C’) A higher magnification of the head ho primordium, respectively. Tdic-Dsx protein localization was cytoplasmic. Scale bars are 50 μm. (D-F) Tdic-Dsx expression patte in 36 h APF, Scale bars are 500 μm. (D’-F’) A higher magnification of the head ho primordium, respectively. Tdic-Dsx protein localization were nuclei. Scale bars are 50 μm. (G) The epidermal regions used for qRT-PCR. The 3D volume image was reconstructed from sequential micro CT images. Blue, head ho primordium (HH); Purple, the head epidermis (non-HH). (H) The relative Tdic-dsx expression level in head ho primordia and head epidermis at 36 h APF in both sexes. Asterisks denote significance: n.s., p>0. 05 ؛*، پ<0.05. HH, head ho primordium epidermis; non-HH, the head epidermis.

شکل 6

فنوتیپ های تشکیل شاخ ناشی از TDIC-TRA RNAi در مراحل دیررس.

.(الف) یک سر زن از نوع وحشی.(ب) تشکیل شاخ کوچک خارج رحمی در یک سر زن.(ج) تشکیل شاخ خارج رحمی به اندازه متوسط در یک سر زن. سه برآمدگی کوچک در Clypeolabrum بر روی سر زن نوع وحشی (A-C ، فلش های Magenta) تشکیل شده است ، در حالی که شاخ های خارج رحمی کوچک یا متوسط خارج رحمی در ناحیه قدامی به سه برآمدگی کوچک (B ، C ، Arrowheads Green) تشکیل شده است. در درمان TDIC-TRA RNAi. میله های مقیاس 5 میلی متر است.

شکل 7

فنوتیپ های تشکیل شاخ ناشی از TDIC-DSX RNAi در مراحل دیررس.

(A-C) بازسازی شاخ قفسه سینه در هنگام رشد شفیرگی در مردان.(الف) شاخ قفسه سینه نر از نوع وحشی.(ب) تقریباً کاهش کامل شاخ قفسه سینه با درمان اولیه TDIC-DSX RNAi (-85 ساعت APF).(ب ") دیدگاه پشتی.(ج) شاخ قفسه سینه بدون مواد مخدر که توسط یک درمان TDIC-DSX RNAi در اواخر (-13 ساعت APF) تشکیل شده است. APF ، پس از تشکیل محفظه puapal. میله های مقیاس 5 میلی متر است.

شکل 8

یک مدل نظارتی برای شکل گیری شاخهای مبهم جنسی در t. DICHOTOMUS

در مردان ، ترکیبی پیش فرض باعث ایجاد TDIC-DSXM می شود ، در حالی که در زنان ، TDIC-TRA (یک ایزوفرم زن ، TRAF) و TDIC-TRA2 ، TDIC-DSXF را با استفاده از TDIC-DSX pre-mRNA تولید می کند. بیان TDIC-DSXM Prepupal در نرها رشد پریموردیا شاخ سر و قفسه سینه را تنظیم می کند ، در حالی که TDIC-DSXF پیش فرض در زنان فعالیت رشد شاخ را سرکوب می کند. در شفیره ، TDIC-DSXM بازسازی شاخ قفسه سینه را تنظیم می کند ، اما برای بازسازی شاخ سر قابل پخش است. GRN ، شبکه نظارتی ژن.

PLOS یک شرکت غیر انتفاعی 501 (c) (3) ، #C2354500 ، مستقر در سانفرانسیسکو ، کالیفرنیا ، ایالات متحده است